1500年，达·芬奇回到佛罗伦萨，随着共和国制度的恢复，文化气氛一度活跃，画坛上也先后出现了米开朗基罗、拉斐尔等杰出人物。达·芬奇开始为兰则塔大教堂的主祭坛创作《圣母子与圣安妮、施洗者圣约翰》，他向市民展出的一幅经过精心构思的《圣母子与圣安妮、施洗者圣约翰》素描草图，立即引起轰动，其构图原理和画法对艺术界有极大影响，米开朗基罗和拉斐尔等人也从中得到启发。

如果说《最后的晚餐》是世界最著名的宗教画，那么，达·芬奇在51岁时自米兰重返佛罗伦萨而作的《蒙娜丽莎》则无愧为世界上最著名、最伟大的肖像画。这两件誉满全球的作品，使达·芬奇的名字永垂青史。1503年，他一面着手为市政厅绘制壁画《安吉里之战》，一面创作《蒙娜丽莎》和《圣母子与圣安妮、圣约翰》（后成为《圣母子与圣安妮》）。这两幅画和《施洗者圣约翰》一起成为他极为珍爱的作品，始终带在身边，晚年移居法国也不离左右，最后遗存巴黎。

在达·芬奇的艺术遗产中，大量的素描习作也颇值得重视，这些素描和他的正式作品一样，同样达到了极高的水平，被誉为素描艺术的典范。其特点是：观察入微，线条刚柔相济，尤其善于利用疏密程度不同的斜线，表现光影的微妙变化，他的每一件作品都以素描作基础。其艺术理论散见于他的6000多页手稿和未完稿的《绘画论》中，这也是文艺复兴时代理论研究的重大成果。

在艺术创作方面，达芬奇解决了造型艺术三个领域——建筑、雕刻、绘画中的重大问题：

1、解决了纪念性中央圆屋顶建筑物设计和理想城市的规划问题；

2、解决了15世纪以来雕刻家深感棘手的骑马纪念碑雕像的问题；

3、解决了当时绘画中两个重要领域——纪念性壁画和祭坛画的问题。

达芬奇的艺术作品不仅能像镜子似的反映事物，而且还以思考指导创作，从自然界中观察和选择美的部分加以表现。壁画《最后的晚餐》《安吉里之战》和肖像画《蒙娜丽莎》是他一生的三大杰作。这三幅作品是达芬奇为世界艺术宝库留下的珍品中的珍品，是欧洲艺术的拱顶之石。

学术界一般将达芬奇的创作活动分为早期和盛期两个阶段。

早期创作

当他在的作坊学艺时，就表现出非凡的绘画天才。约1470年他在协助韦罗基奥绘制《基督受洗》时，虽然只画了一位跪在基督身旁的天使，但其神态、表情和柔和的色调，已明显地超过了韦罗基奥。据传，韦罗基奥为此不再作画。现存他最早的作品《受胎告知》是达·芬奇在没有老师的指导下，独立完成的一件作品。除了有一点自由构思外，这幅画的场景都是达芬奇遵循一般的透视画法来构思的。后来位于欧利维特峰的圣巴托罗梅欧修道院还订购了这幅作品。稍后创作的《吉内薇拉·班琪》，一反15世纪艺术追求线条分明的传统，以逆光夕照的色调渲染他所倡导的透视效果。1481年创作的《博士来拜》（又译《三王来拜》），是标志其艺术风格达到成熟期的作品。该画虽由于他动身去米兰而没有完成，但从原稿上可看出其构图和形象塑造所显示的艺术创新，大大超越了他的老师和同辈：由圣母婴孩和三位博士所形成的三角形稳定构图，按精确的透视法画的建筑遗迹和奔腾飞跃的马群等背景，说明他已不再从叙事的角度简单地罗列有关人物，而是对传统的题材进行彻底的改造。他所采用的色调幽暗的画法，使人物形象从阴影中突出，突破了传统绘画明晰透露的特点，预示着文艺复兴的到来。